کلونینگ و بیان ژن آنزیم مالتوژنیک آمیلاز از یک سویه ترموفیل ژئوباسیلوس و تعیین خواص بیوشیمیایی و ساختاری آن

مالتوژنیک آمیلازها یک گروه از آنزیم های هیدرولیز کننده سیکلودکسترین ها و متعلق به خانواده آلفا-آمیلازها (خانواده 13 گلیکوزیل هیدرولازها) می باشند. این آنزیم برخلاف سایر آلفا-آمیلازها داخل سلولی است و همچنین فعالیت هیدرولازی و ترانس گلیکوزیلاسیون را از خود نشان می دهد. اخیرا توجه به استفاده از این آنزیم در صنعت بخصوص در صنایع نانوایی، شیرینی پزی و همچنین پزشکی و نیز طراحی داروها چشمگیر بوده است. با توجه به اینکه مالتوژنیک آمیلازها از نظر کاربردی و تحقیقاتی بسیار با اهمیت هستند و تاکنون از سویه های بومی ایران گزارش نشده اند، در این تحقیق ژن آنزیم مالتوژنیک آمیلاز از یک سویه جدید ژئوباسیلوس ترموفیل جدا و در حامل pet28a کلون شد. پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی تخلیص و سپس خصوصیات بیوشیمیایی و ساختاری آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. اثر دما و ph های مختلف بر روی فعالیت مالتوژنیک آمیلاز نوترکیب، فعالیت بهینه را درc° 65 نشان داد که نسبت به مالتوژنیک آمیلازهای جداشده ای که تاکنون تعیین خصوصیت شده اند بالاتر می باشد و ph اپتیمم برای فعالیت آنزیم 6 بدست آمد. اثر غلظت های متفاوت یون های فلزی مشخص کرد که فعالیت کاتالیتیک آنزیم در حضور یون های li+ و k+ افزایش، اما در حضور سایر یون های بکار رفته کاهش یافته و یا مهار می شود. همچنین k+ و ca2+ به ترتیب موجب افزایش و کاهش پایداری حرارتی آنزیم شده و اثر ناپایدارکنندگی کلسیم و پایدارکنندگی پتاسیم به ترتیب آنتالپیک (کاهش h#?) و آنتروپیک (کاهش s#?) تعیین شد. با بررسی اثر سوبستراهای مختلف (?، ?، ? –سیکلودکسترین، آمیلوز، آمیلوپکتین و گلیکوژن) بر روی فعالیت آنزیم مشخص شد که سه سوبسترای سیکلودکسترین (, ?-, ?-cd-?) نسبت به سوبستراهای پلیمری (آمیلوپکتین، آمیلوز، گلیکوژن و نشاسته) سوبستراهای بسیار مطلوب تری برای آنزیم می باشند و این می تواند به علت ممانعت فضایی بیشتر سوبستراهای پلیمری باشد. پارامترهای سینیتیکی و ترمودینامیکی محاسبه شده برای سوبستراهای مختلف نیز این موضوع را تأیید می کنند. در مورد سه سوبسترای سیکلودکسترینی، علیرغم اینکه km آنزیم در حضور ?-cd، نسبت به ?-, ?-cd افزایش یافته، اما ویژگی سوبسترایی (kcat/km) آنزیم از ?-cd به ?-cd به ترتیب افزایش یافته است زیرا kcat آنزیم در حضور این سوبستراها به ترتیب افزایش قابل ملاحظه ای را نشان می دهد. بررسی ترمودینامیک واکنش فعال سازی نشان می دهد که این افزایش فعالیت (کاهش g#?) در سوبستراهای فوق آنتروپیک (افزایش s#?) می باشد. اتصال سوبستراهای ?-, ?-cd از نظر میانکنش هایی که با رزیدوی های جایگاه فعال دارند با روش شبیه سازی میانکنش آنزیم-سوبسترا مورد بررسی قرار گرفت که نشان می دهد سطح در دسترس رزیدوی های جایگاه فعال و کاتالیتیک در حضور ?-cd در آنزیم به مراتب بیشتر از ?-cd است که می تواند نشان دهنده میانکنش های بیشتر در حالت گذار آنزیم- سوبسترا برای ?-cd باشد. این نتیجه، h#? بیشتر حالت گذار واکنش فعال سازی و افزایش km آنزیم در حضور ?-cd در مقایسه با ?-cd را به خوبی تایید می کند.